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                    产品中心 > 质粒DNA提纯系列 > 高纯度质粒DNA大量提取试剂盒(硅胶沉淀法)(N1041)

                    高纯度质粒DNA大量提取试剂盒(硅胶沉淀法)(N1041)

                    价格: 897.00

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                    N1041(10次)

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                    产品组分
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                    溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

                    溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液PB中含有碱与变性剂,请不要直接接触皮肤。

                    上述产品组分均可单独购买,详见产品索引。


                    保存条件

                    RNase A:-20℃保存。RNase A为浑浊溶液。初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于4℃保存??杀4?个月。

                    其他试剂:室温保存。

                    若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

                     

                    产品说明

                    本产品采用了经典的硅胶纯化及碱裂法技术,用于高纯度质粒DNA的大量纯化。纯化原理是碱裂解细菌后,硅胶液高效可逆地吸附体系中的质粒DNA(高盐、低

                    pH值),蛋白及其它杂质不被吸附而被除去,被吸附的质粒DNA在低盐、高pH值条件下再被洗脱出来。一次可从100 ml的过夜培养的菌液中提取400-1000 μg

                    高纯度质粒DNA(OD260/280 = 1.7-1.9),此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。

                     

                    产品特点

                    • 高效:一次可获得400-1000 μg高拷贝质粒DNA。
                    • 高纯度:OD260/OD280 = 1.7-1.9。无须再纯化,可直接使用。
                    • 灵活:菌体提取规模灵活可控。

                     

                    产品用途

                    • 常规限制性酶切
                    • PCR扩增
                    • 转化
                    • DNA序列测定
                    • 体外转录

                     

                    质量控制

                    从大肠杆菌提取pGEM质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。

                     

                    图1  质粒DNA纯化流程图

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                    操作方法

                    1  收集100 ml菌液。8,000 rpm离心5min,弃上清。尽量吸除上清,为确保上清液全部吸取,请倒置干净的吸水纸上。

                        注:应根据所培养菌体的浓度与拷贝数确定收集的菌液量。如果菌液浓度过低或低拷贝质粒,可收集2次100 ml菌液,并将菌体沉淀收集到一个离心管中。菌体的体积与质

                    ??奖词渭⒁馐孪?。

                    2  加入7.5 ml溶液Ⅰ/ RNase A混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全悬浮。室温静置5-10min。

                    注:初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于4℃保存??杀4?个月。

                    不要残留细小菌块。菌液重新悬浮充分与否对于获得高产量非常重要。

                    室温静置5-10min是为使溶液中的RNA被充分降解。

                    3  加入7.5 ml溶液Ⅱ,立即轻柔地反复颠倒混匀12次。室温放置3min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。

                        注:若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

                                加入溶液Ⅱ后,不可剧烈混和,否则会使染色体DNA断裂。。此时菌液应变得清亮粘稠,如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。

                    4  加入10 ml溶液Ⅲ,立即轻柔地反复颠倒混匀6-10次。此时会出现白色絮状沉淀。

                       注:加入溶液Ⅲ后,应立即混匀避免产生局部沉淀。

                    5  12,000 rpm室温离心12min,收集上清。

                    6  将上清置于新的50 ml离心管中。按照每25 ml上清液中加入1.2 ml硅胶纯化液的比例,向所获上清中加入硅胶纯化液。反复颠倒混匀6次直至溶液呈现乳状,

                    室温放置5min。

                         注:加入硅胶纯化液的体积,可根据上清液的量等比例调整。

                    7  12,000 rpm 离心2min,弃上清液。

                        注:此时质粒DNA被吸附于硅胶上并沉淀在管底。

                     8  加入10 ml 溶液PB,漩涡振荡使硅胶沉淀完全悬浮。12,000 rpm 离心2min,弃上清液。

                        注:此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量质粒DNA。

                    9  加入10 ml溶液W,漩涡振荡使沉淀完全沉淀悬浮。12,000 rpm 离心2min,弃上清液。

                       注:溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

                    10加入10 ml溶液W,漩涡振荡使沉淀完全沉淀悬浮。12,000 rpm 离心2min,弃上清液。

                    11用移液器吸干管底及管壁上残留的液体。打开离心管盖,于室温晾干30min(或者超净台吹干15min)。

                       注:此步骤的作用是去除残余酒精,避免降低质粒的生物学活性,影响下游酶促反应。

                    12加入1.5-2 ml溶液Eluent(65℃预热),漩涡振荡使沉淀完全悬浮。室温放置5min,12,000 rpm离心2min。上清液即为质粒DNA溶液,吸取移至一新离心管

                    于-20℃保存。

                        注:溶液Eluent可用无菌双蒸水代替,但其pH需为8.0-8.5,加入体积视质??奖词嗌?、用户对质粒浓度要求而定。

                                对溶液Eluent  65℃预热,会提高提取质粒DNA

                    的得率。

                     

                    图2  质粒DNA电泳图

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                    注意事项

                    1  提取的质粒量与细菌培养浓度、质??奖词纫蛩赜泄?。如果所提质粒为低拷贝质?;虼笥?0 kb 的大质粒,应加大菌体使用量。高拷贝质粒推荐使用量

                    为100ml,得率一般在0.5 mg~1.5 mg 左右;低拷贝质粒推荐使用量为200ml,得率一般在200~400μg。溶液Eluent 应在65℃水浴预热,在吸附和洗脱时可以

                    适当的延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。

                    2  所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm(约13,400×g)。

                    3  所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm(约13,400×g)。

                    4 溶液 Eluent(10 mM Tris-HCl, pH 8.5)中不含EDTA,其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等,不会影响后续试验。

                     

                    质粒DNA浓度与纯度检测

                    1  利用紫外分光光度计检测时,OD260值为1 相当于大约50 μg/ml 双链DNA。高纯度的质粒DNA OD260/280通常在1.7-1.9 左右。如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,

                    而使用去离子水,比值会偏低,但并不表示纯度低,因为pH 值和离子存在会影响光吸收值。

                    2  利用琼脂糖凝胶电泳检测时,理想情况是只出现单一超螺旋条带。然而,再质粒提取过程中,由于机械剪切、酸碱度等原因,使质粒DNA发生断裂。电泳

                    时可能出现1-3条带,电泳迁移率从大到小,分别为超螺旋质粒、开环质?;蚋粗浦屑涮?。但是,只要质粒DNA经过单酶切鉴定后(单酶切位点),呈现单

                    一条带,就表明没有基因组DNA的污染。


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