<address id="rnhrh"><form id="rnhrh"></form></address>

      <form id="rnhrh"></form>

                    <form id="rnhrh"></form>

                    产品中心 > 反转录系列 > RT-kit(逆转录试剂盒)(R1011-R1012)

                    RT-kit(逆转录试剂盒)(R1011-R1012)

                    促销: 780.00~3250.00

                    分享

                    运费 ¥0.00
                    R1011 (20次) R1012 (100次)

                    RT-PCR Kit(逆转录试剂盒)

                    产品说明

                    RT-PCR Kit(逆转录试剂盒)是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的、具有高灵敏度的RT-PCR反应系统。该系统合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分,优化的体系保证了M-MLV具有高效的逆转录酶活性,所得cDNA对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好,可用于检测稀有基因的表达、从极少数细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。

                    M-MLV逆转录酶是由一个71 kD的单亚基组成的重组型DNA逆转录聚合酶??梢源呋?/span>RNADNARNA杂交链为模板的互补DNA 的聚合反应。本酶经修饰RNase H活性比普通的逆转录酶要弱很多,因此在合成第一链cDNA的过程中,可保证RNA的降解程度较低,从而使得率提高。

                    产品组分

                    货号

                    R101120次)

                    R1012100次)

                    M-MLV200U/μl

                    20 μl

                    100 μl

                    RNasin40U/μl

                    12 μl

                    60 μl

                    Oligo d(T)15 Primer50 μM

                    20 μl

                    100 μl

                    Random primer50 μM

                    20 μl

                    100 μl

                    5xfirst-strand buffer

                    80 μl

                    400 μl

                    RNase-free ddH2O

                    1 ml

                    1 ml×5

                    dNTPs(10mM each)

                    50 μl

                    250 μl

                    R1011可进行20次逆转录反应,R1012可进行100次逆转录反应(20 μl 标准PCR反应体系,每次使用 M-MLV 1μl)。

                    M-MLV 储存液

                    20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

                    200 mM NaCl

                    0.1 mM EDTA

                    1 mM DTT

                    0.01% NP-40

                    50% glycerol

                     

                    5xfirst-strand buffer 成分

                    250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

                    375 mM KCl

                    15 mM MgCl2

                    50 mM DTT

                     

                    质量检测

                    逆转录酶活性检测

                    使用[32P]dCTP作为标记,200 U M-MLV1μg、1.2 kbRNA为模板进逆转录反应,最低可得到120ngcDNA,所得cDNA长度 > 全长的90%。

                    核酸外切酶活性检测

                    混合50ng的标记DNA RNA200U M-MLV反应缓冲液体系中,37℃温浴1 h,检测DNARNA降解都不到总量的1%。

                     

                    适用范围

                    第一链cDNA 合成

                    cDNA文库构建

                    RT-PCR

                    引物延伸

                    3'5' RACE

                     

                    注意事项

                    l  成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA SDS。用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能用高压灭菌处理时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行过滤除菌处理。

                    l  为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl0.2 M同时加入4倍体积的乙醇,室温放置3-5 min,10,000 rpm离心5 min。

                    l  在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂(RNasin)以增加cDNA合成的长度和产量。在第一链合成反应中,RNase抑制剂在缓冲液和还原剂(如 DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放出RNase。但是RNase抑制剂仅防止RNase A,B,C RNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了RNase抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase。

                    l  较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开,增加反应的产量。

                    l  使用简单的RNA纯化方法即可获得满足RT-PCR反应的RNA,但为了保证实验的成功率,建议使用GTC法(异硫氰酸胍法)制备的高纯度RNA。

                    l  为防止RNA降解,应尽量避免反复冻融,最好保存于-70℃。

                    l  最佳的PCR反应条件,因PCR扩增仪的不同而不同,所以在使用您的样品之前最好先试做一下control反应,以确定最佳的PCR反应条件。

                    l  cDNA产物应置于-20℃保存。

                    l  当以cDNA为模板进行PCR之前,使用RNase H处理cDNA,可以提高PCR反应的灵敏度。

                     

                    操作步骤

                    1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物

                    1-5μg RNA

                    1μl Oligo(dT)15 Random primer,

                    RNase-free ddH2O13.4μl;

                    2进行变性退火反应

                    70℃温浴5 min,

                    简短离心后冰浴5 min;

                    3在上述离心管中配制反转录反应液

                    4 μl  5×first-strand buffer

                    1 μl  dNTPs10 mM each

                    0.6μl  RNasin ,

                    1 μl   M-MLV;

                    4按下列条件进行反转录反应

                    Oligo (dT)15 42℃温浴60 min;

                    Random primer 37℃温浴60 min。

                    5终止反应

                    70℃温浴5 min终止反应,置冰上进行后续实验或-20℃保存。

                    6RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μl,取2-5μl进行PCR扩增反应。

                    姓名
                    电话号码
                    电子邮箱
                    公司名称
                    地址
                    留言*
                     
                    验证码
                    提交
                    正规手机购彩 <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链>